PTC翻译成中文(ptc英文)
iSynBio造物联合合成生物学竞赛推出《大赛项目揭秘专题》，本期为第九期，嘉宾为厦门大学Synbio-XMU团队，参赛项目为PTC疫苗有望挑战所有病毒？
联合发布：《合成生物学》期刊、生物世界、iSynBio爱星博、深圳市合成生物学协会。
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项目内容概述
在病毒的基因组多个基因位点突变成终止密码子的序列，使得病毒在人体中的翻译提前终止，无法产生完整的子代病毒。这种含有提前终止子PTC (Premature termination codon) 突变的病毒基因组和正常的病毒蛋白可以组装出类病毒颗粒，即PTC类病毒或PTC疫苗。它没有病毒毒性，但能引起人体产生高效免疫的武器。但现有PTC疫苗均无法突破在实验室难以大量生产的问题。本项目首先设计并构建了能识别终止密码子的ACE-tRNA，若将其引入酵母细胞，可以利用含有PTC位点的病毒基因组合成正常的病毒蛋白，有望解决PTC疫苗生产问题。
随后，本项目通过PTC-GFP（含有提前终止子突变的GFP）作为报告基因验证了识别终止密码子的ACE-tRNA的有效性。同时还用Cas9技术改造了酵母的工程菌株。后续将以肠道病毒EV71为例，尝试利用酵母细胞生产EV71-PTC疫苗。这些PTC疫苗生产工艺的改进有望应用到更多致病病毒相关的PTC疫苗开发。希望我们开发的PTC疫苗制备方法能促进疫苗学的研究，为全球公共卫生事业的发展和新冠疫苗的研发提供新的方案。
项目背景
据世卫组织公布的数据，截止2022年6月16日，全球共有超过200多个国家/地区累计新冠确诊病例5.352亿例，疫苗研发成为世界关注的焦点。目前五条疫苗研发技术路线，分别为灭活疫苗、减毒活疫苗、核酸疫苗、腺病毒载体疫苗和重组蛋白疫苗，但开发周期都比较长。PTC疫苗具有通用性，适用于多种病毒，可以通过多点突变的方式，快速研发，特别是急性感染病毒的疫苗开发有独特的潜力。PTC疫苗为疫苗研发提供了新思路。
反密码子编辑tRNA（ACE-tRNA，anticodon engineered transfer RNA）指反密码子环序列经过人为改造的tRNA。本项目将丝氨酸Ser的tRNA的反密码子改造为终止密码子（UAG、UGA、UAA）。这三种ACE-tRNA能够将PTC位点引入丝氨酸Ser，避免提前终止而产生正确的蛋白。将ACE-tRNA引入酵母细胞，则能将含有PTC位点的病毒基因组翻译出正确的病毒蛋白，进而用于制备PTC疫苗。
无义介导的mRNA降解(NMD, nonsense-mediated mRNA decay)是指在病理或正常生理情况下mRNA上出现了提前终止密码子(PTC)，从而导致mRNA降解的现象。它是一种广泛存在的mRNA质量监控机制。mRNA在有提前终止密码子PTC存在时，翻译产生的截短蛋白往往具有细胞毒性，NMD的存在有助于避免截短蛋白的产生。为了提高外源基因mRNA（含有PTC位点）的稳定性，本项目开发了缺失NMD途径的酵母底盘菌株。
项目总体技术路线
技术路线图
1）正常的病毒基因组（不含PTC位点），能翻译正常病毒蛋白，具有毒性和免疫原性。含有PTC位点的病毒基因组，只能翻译出截断的病毒蛋白，无法组装出病毒。
2）含有PTC位点的病毒基因组，在有ACE-tRNA存在的情况下，能翻译出正常的病毒蛋白。含有PTC位点的病毒基因组和正常的病毒蛋白可以组装出PTC类病毒，即PTC疫苗。
3）利用Cas9技术敲除NAM7基因获得缺失NMD途径的酵母菌株，含有PTC位点外源基因的mRNA不容易被降解。
项目主要成果
1.设计并构建识别终止密码子的ACE-tRNA
考虑到酵母中终止密码子UAG、UAA、UGA密码子丰度不同，我们将丝氨酸tRNA的反密码子环设计为分别含有三种终止密码子的ACE-tRNA。实验中，我们将丝氨酸tRNA的基因克隆出来连接到质粒载体上，并引入终止密码子相应的TAA、TGA、TAG突变，将三种突变的质粒转化大肠杆菌获得转化子。（见下图）
三种ACE-tRNA基因
(含终止密码子相应的突变)质粒的转化子
2.筛选对酵母毒性较小的ACE-tRNA
除了与外源基因的PTC位点的终止密码子结合之外，三种ACE-tRNA还可能与酵母正常基因mRNA的终止密码子结合，从而导致酵母蛋白的翻译不能正确停止，产生大量无法正常终止而过长的无用蛋白，进而影响酵母生长速度，因此生长曲线的测定可以间接反映ACE-tRNA与正常终止tRNA的竞争情况。实验表明UAA突变版本的ACE-tRNA对酵母毒性相比于UAG和UGA的更小。（见下图）
三种突变long-tRNA与对照组OD600变化比较
3.构建报告基因突变版的GFP验证ACE-tRNA的有效性
为了验证ACE-tRNA的有效性，我们构建了将第147位点突变为终止密码子的绿色荧光蛋白GFP，即PTC-GFP作为报告基因。将PTC-GFP和ACE-tRNA共转到酵母细胞中，预期能够成功翻译终止密码子的tNRA产出绿色荧光蛋白（见下图）。但是，共转的各实验组中均未能观察到明显绿色荧光，仅有较弱的绿色荧光。经过分析酵母的NMD途径的存在可能是共转实验未能得到较强的绿色荧光的原因。
报告基因PTC-GFP和ACE-tRNA共转到酵母
示意图
4.构建缺失NMD途径的酵母作为PTC类病毒的生产底盘菌
利用cas9技术敲除NMD途径关键基因NAM7（见下图红框）。
NAM7基因敲除的酵母细胞鉴定图
随后，在缺失NMD途径的酵母中，共转ACE-tRNA和PTC-GFP，获得到较强的绿色荧光，相同条件下WT酵母菌株仅有极低的荧光效果（见下图），相关数据图标还在统计中。可见在缺失NMD途径的酵母菌株中外源基因（含有PTC位点）的mRNA不容易被降解。
ACE-tRNA与PTC-GFP
共转NMD途径敲除的酵母
（左侧是缺失NMD途径敲除的菌株；中部是酵母WT菌株；右侧是阴性对照）
鉴于目前的实验结果，后续需对PTC类病毒颗粒的表达方案展开探究，检测病毒免疫原性、进行动物实验验证PTC疫苗的有效性。后续也可借助tRNA的定向进化筛选出更高效的ACE-tRNA版本，为PTC疫苗研究提供重要思路。
项目完整内容（Wiki网页）
http://www.synbiochallenges.com/wiki/2021/SynBioC_XMU/Protocol.html
我们是来自厦门大学的
Synbio-XMU团队
王子傲（队长）
厦门大学生命科学院学院本科生
魏翘楚
厦门大学公共卫生学院本科生
张丹丽
厦门大学生命科学学院研究生
吴娜
厦门大学生命科学学院本科生
夏伊澜
厦门大学公共卫生学院本科生
曹宇
厦门大学公共卫生学院本科生，喜欢各类体育运动。
吴滢洁
厦门大学信息学院软件工程专业本科生
霍子轩
化学化工学院18级化学生物学系 Per Aspera Ad Astra
万澄雨
厦门大学医学院口腔医学系2021级本科生
伍桐瑶
很开心能跟大家一起头脑风暴，一起做实验，一起进步！
陈智超
嘿呦what's up man~
刘桂杉
一个对世界充满好奇心的未来医生。
刘元媛
生活奇奇怪怪，而我可可爱爱。
马跃
厦门大学20级生物科学交流生
陈权欣
清醒时做事，糊涂时读书;
大怒时睡觉，独处时思考。
#指导老师
袁吉峰
厦门大学生命科学学院
闽江学者特聘教授
#指导顾问
商志云
张子钰
合成生物学是生命科学领域一门新兴的前沿交叉学科和典型的汇聚技术。它通过融合工程科学理念与生命科学原理及基于多学科的使能技术，设计合成新的或改造天然的生命系统，揭示生命规律、构筑新一代工程生物体系；被喻为“认识生命的钥匙”（造物致知）、改变未来的颠覆性技术（造物致用）。
合成生物学竞赛-创新赛主要面向在校大学生以及在读硕士研究生。本届创新大赛包括医疗、农业、环境、制造、信息、基础研究及创新应用等多个领域，鼓励学生从兴趣出发，探索合成生物学在不同领域的创新和应用。首届创新大赛将于 2022 年 7月9-10日在深圳理工大学线下举行。
大赛由中国生物工程学会合成生物学分会指导和主办。大赛由二十多家高校和研究所共同发起。大赛的共同承办单位是中国科学院深圳理工大学（筹）合成生物学院、中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所、深圳合成生物学创新研究院、深圳市合成生物学协会、 深圳市工程生物产业创新中心、DeepTech。大赛的支持单位为光明区委区政府。
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作者 |Synbio-XMU团队
校对 |鲲
编辑 |果粒珍珍
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